蛋白质检测方法（蛋白质浓度测定常用的三种方法）,蛋白质浓度计算公式

蛋白质检测方法（蛋白质浓度测定常用的三种方法）蛋白质检测方法(三种常用的蛋白质浓度测定方法)，测定蛋白质浓度的方法很多，如紫外吸收法、缩二脲法、BCA法、劳里法、考马斯亮蓝法、凯氏定氮法等。目前，本文采用紫外、BCA、考马斯亮蓝三种方法，并详细介绍了这三种方法的原理、优缺点、操作及注意事项。

蛋白质检测方法（蛋白质浓度测定常用的三种方法）

紫外线法

这种方法是在280纳米波长下直接测试蛋白质。选择Warburg公式，光度计可以直接显示样品的浓度，或者选择相应的换算方法将吸光度值换算成样品的浓度。蛋白质测定的过程非常简单。先测试空白溶液，然后直接测试蛋白质。所以结果很不稳定。直接蛋白质定量法适用于检测成分相对单一的较纯蛋白质。与比色法相比，紫外直接定量法快速、操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，比如DNA此外，灵敏度低，蛋白质浓度高。

(1)简单经验公式蛋白质浓度(毫克/毫升)=[1.45 * od280-0.74 * od260] *稀释系数

(2)通过计算OD280/OD260的比值进行精确计算，然后查表得到修正系数f，再通过以下公式计算出最终结果：

蛋白质浓度(毫克/毫升)=氟*(1/天)*外径280 *天

其中d为测量OD值的比色杯厚度

d是溶液的稀释倍数

BCA方法

原理BCA(bichinchoninic acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂混合成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，当BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2还原为Cu，工作试剂由原来的苹果绿变为紫色络合物。在562纳米处，光吸收强度与蛋白质浓度成正比。

BCA蛋白浓度测定试剂盒和艾博金蛋白定量试剂盒(BCA法)提供了一种简单、快速且与去污剂相容的方法来准确定量总蛋白。

成分试剂A100毫升试剂B2毫升标准蛋白1毫升2 2.1毫克/毫升

贮藏条件和运输温度：室温(标准蛋白在4 ~ 8运输)

储存温度：室温(标准蛋白质储存在-20)

生效日期：12个月

使用方法

方法1: 96孔板

1.BCA工作液的配制：根据标准品和样品的数量，按50体积的试剂a和1体积的试剂B配制适量的BCA工作液.混好。

2.将0 L、1 L、2 L、4 L、6 L、8 L、10 L蛋白质标准品加入96孔板的蛋白质标准品孔中。加入灭菌的双蒸水至10微升.取10 L待测样品，加到96孔板的样品孔中。每次测定应平行2 ~ 3次。

3.将200 L BCA工作液(即样品与工作液的体积比为13，336，020)加入待测样品孔和蛋白质标准孔中，混合均匀。

4.37水浴30分钟。冷却至室温。

5.吸光度用562纳米的微孔板读数器测量。

6.制作标准曲线。从标准曲线计算样品浓度。

测定蛋白质浓度的三种常用方法(详细说明)

方法2:试管法

1.工作液的配制：根据标准品和样品的数量，按50倍体积的试剂a和1倍体积的试剂b配制适量的BCA工作液，充分混合均匀。工作溶液的量应与用于测定的比色杯相对应。每次测定应平行2 ~ 3次。这里列出的比色系统使用0.5毫升比色杯。如果比色皿的规格不同，则需要将系统扩大到实验中准确读取比色皿所需的体积。

2.BSA标准品和样品的制备：样品用水或其他不干扰显色反应的缓冲溶液制备，使待测浓度位于标准曲线的线性部分。为每个反应准备了三个平行的分析。标准曲线一般有5~6点。根据样品的估计浓度确定各点的具体浓度。牛血清白蛋白可以用水或与样品一致的溶液稀释。如果待测样品的浓度约为200微克/毫升，可按下列顺序加入牛血清白蛋白标准品、样品和BCA工作溶液。

3.取适量标准蛋白，按蛋白液与工作液的比例=1:20混合均匀。37温水浴30分钟。冷却至室温。

4.测量样品和标准品在562纳米处的吸光度。

测定蛋白质浓度的三种常用方法(详细说明)

考马斯亮蓝法

实验原理考马斯亮蓝法是一种基于蛋白质-染料结合原理的快速、灵敏的微量蛋白质浓度定量方法。这种蛋白质测定方法比其他方法具有突出的优势，因此得到了广泛的应用。该方法是目前最灵敏的蛋白质测定方法之一。

考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料最大吸收峰(lmax)的位置由465 nm变为595 nm，溶液颜色由棕黑色变为蓝色。通过测量595纳米处光吸收的增加，可以知道与其结合的蛋白质的量。发现染料主要与蛋白质中的碱性氨基酸(尤其是精氨酸)和芳香族氨基酸残基结合。

突出优点：(1)灵敏度高，估计比Lowry法高4倍左右，其最低蛋白质检测量可达1 mg。这是因为蛋白质和染料结合后颜色变化较大，蛋白质-染料复合物的消光系数较高，所以吸光值随蛋白质浓度的变化远大于Lowry法。

(2)测定快速简单，只需一种试剂。完成一个样品的测定只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质的结合过程，约2分钟即可完成，1小时内颜色可保持稳定，5分钟至20分钟之间颜色稳定性最好。所以完全没有必要像劳里法那样花时间，严格控制时间。

(3)干扰物质少。如K、Na、Mg2、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等干扰洛瑞法，不干扰本测定方法。

缺点(1)由于各种蛋白质中精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，考马斯亮蓝染色法对不同蛋白质的测定存在较大偏差。通常选择g-球蛋白作为制作标准曲线中的标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

(2)仍有一些物质干扰该方法的测定。主要干扰物质有洗涤剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。

试剂和设备1。考马斯亮蓝试剂：

将100毫克考马斯亮蓝g-250溶于50毫升95%乙醇中，加入100毫升85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000毫升。

2.标准和测试蛋白质溶液(1)标准蛋白质溶液

将牛血清白蛋白结晶，预先用微量凯氏定氮法测定蛋白质氮含量，根据纯度用0.15 mol/L NaCl配制1 mg/mL蛋白质溶液。

(2)待测蛋白质溶液。使用前，人血清用0.15摩尔/升氯化钠稀释200倍。

3.设备试管1.515 cm(6)，试管架和移液管0.5mL(2)；1毫升(2)；5mL(1)；恒温水浴；分光光度计。

操作方法1。从制作标准曲线上取7个试管，按照下表并行操作。

摇匀，以0号试管为空白对照，在1小时内比较595 nm处的颜色。

绘制标准曲线：以A595 nm为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

二、未知样品蛋白质浓度的测定方法同上，取适当的未知样品体积，使其测量值在标准曲线的直线范围内。根据测得的A595 nm值，在标准曲线上发现相当于标准蛋白质的量，并且蛋白质浓度

注(1)添加试剂后，在5-20分钟内测量光吸收，因为在此期间颜色最稳定。

(2)测定过程中，蛋白质-染料复合物的一小部分会吸附在比色杯壁上。测定后，可用乙醇洗涤蓝色比色杯。

(3)用考马斯亮蓝法分析蛋白质必须掌握分光光度计的正确使用。重复测量吸光度时，比色杯必须清洗干净。制作蛋白标准曲线时，最好从低浓度到高浓度测量蛋白标准，以防误差。

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